LAB-4 CROMATOGRAFÍA DE CAPA DELGADA

UNIVERSIDAD DE PANAMÁ

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

QUÍMICA ORGÁNICA (QM 110)

LABORATORIO Nº 4

CROMATOGRAFÍA DE CAPA DELGADA

Prof. Colombia L. Wong 

Prof. Liliana L. Escalante

1.    INTRODUCCIÓN:

Los métodos cromatográficos permiten fraccionar los componentes de una mezcla, ya que dependen de una migración selectiva y diferencial de los solutos a través de un sistema de dos fases. En este laboratorio utilizaremos la cromatografía de capa fina (TLC) para separar los pigmentos en la espinaca.

2.    OBJETIVOS:

·         Relacionar al estudiante con la técnica de cromatografía de papel como una manera sencilla de separar los componentes de un extracto.

·         Identificar las fases que componen la cromatografía.

3.    MARCO TEÓRICO:

La cromatografía es muy empleada para obtener y purificar algunas sustancias tales como: antibióticos, medicinas y productos industriales. Se puede dividir en cromatografía en columna, en papel, en capa delgada y en fase gaseosa. La cromatografía en papel y la de capa delgada son empleadas con fines analíticos en la determinación de materiales que se encuentran en pequeñas cantidades. La cromatografía en papel, lo mismo que la de capa delgada, son muy simples con técnica fácil de dominar y que permite identificar componentes que se encuentran en milésimas de miligramos. Además permiten determinar e identificar componentes en productos comerciales, líquidos, biológicos minerales y tejidos. (Domínguez, 1980).

La cromatografía de capa fina se conoce normalmente por sus siglas en inglés (TLC, thin layer chromatography). Es una técnica muy utilizada para la identificación y determinación de pureza de compuestos. También puede utilizarse como técnica de separación (cromatografía de capa fina TLC preparativa) a muy pequeña escala.

En esta técnica la fase estacionaria es una capa fina de gel de sílice u otro soporte con propiedades adsorbentes (en nuestro caso de 25 mm de espesor) dispuesta sobre un soporte de vidrio o aluminio que denominaremos placa. El eluyente o fase móvil será la mezcla de disolventes adecuada.

a. Aplicación de la muestra

La introducción de la muestra se realiza utilizando un tubo capilar. Para ello se ha de disolver una pequeña cantidad de la muestra a analizar en un disolvente volátil. A continuación, el extremo del tubo capilar se introduce en la disolución. La disolución ascenderá por el tubo por capilaridad. En uno de los lados de la placa, aproximadamente a 3 mm del borde, se ha de trazar a lápiz una línea recta, línea base, y sobre ella unos puntos de referencia. Sobre dichos puntos se pincha con el tubo capilar, de modo que una pequeña cantidad de la disolución pase a la placa. De esta manera, la muestra queda adsorbida por el soporte sólido en la placa.

b. Realización del cromatograma: Correr una placa.

El cromatograma se realiza en una cubeta que contiene el eluyente elegido. El nivel del eluyente debe de ser menor que la separación entre el borde de la placa y la línea base - el lugar donde se ha efectuado el pinchazo. La placa se introduce en la cubeta y se tapa. El eluyente asciende por la placa por capilaridad, arrastrando a su paso a los componentes de la mezcla. Naturalmente los componentes de la mezcla son arrastrados con diferente velocidad, de acuerdo con su distinta polaridad. Cuando el frente del eluyente llega casi al borde superior de la placa, esta se extrae de la cubeta. Se debe de trazar una nueva línea a lápiz indicando el nivel hasta el que ha ascendido el eluyente.

Polaridad de los compuestos orgánicos en orden creciente:

hidrocarburos < olefinas < flúor < cloro < nitro < aldehído

aldehído < éster < alcohol < cetonas < aminas < ácidos < amidas

c. Revelado del cromatograma

Una vez que el eluyente sobre la placa se ha secado se ha de proceder a la visualización del cromatograma. En determinados casos, si los compuestos son coloreados esto puede realizarse de forma directa. Sin embargo, para compuestos incoloros es necesario utilizar diferentes técnicas de revelado.

Las placas de cromatografía comerciales portan un agente fluorescente inorgánico en la fase estacionaria. Ello permite visualizar el cromatograma iluminando la placa con una lámpara de luz ultravioleta UV. Los diferentes compuestos aparecen en la placa como manchas circulares. Las distintas manchas deben de marcarse a lápiz sobre la placa para su estudio posterior.

Diferentes reactivos orgánicos también permiten el revelado permanente de la placa, obteniéndose manchas coloreadas en ella. De entre los métodos más comunes puede destacarse la utilización del Iodo. Para ello la placa se introduce en una cubeta que contiene cristales con Iodo y se deja estar en ella durante unos minutos. Los vapores de iodo se disuelven en las manchas de los compuestos orgánicos tiñéndolas de color marrón (Manual de pruebas).

Domínguez (1980) afirma que cuando los materiales que se tratan de identificar son incoloros, se efectúa la cromatografía y una vez que el disolvente (fase móvil) ha alcanzado una determinada altura, se detiene la operación, se seca el papel o la capa delgada y finalmente se cubre son na dispersión muy fina de un reactivo que dé reacciones coloridas con el material a identificar, los que aparecen como unas manchas.

4.     TÉCNICA OPERATORIA: 

·         Utilizando una placa para cromatografía, trace una línea horizontal del origen a más o menos 1.5 o 2 cm.

·         Coloque círculos sobre la línea, que le permita diferenciar las muestras, aplique sobre estos con el uso de un capilar una o dos manchas de la muestra, deje evaporar el solvente y aplique nuevamente.

·         Una vez implantadas las muestra coloque la placa en una cámara que contenga una mezcla de solventes butanol:ácido acético:agua (6:4:2) de aproximadamente 1cm de altura (no debe tocar el punto donde empieza la mancha).

·         Cubra la cámara y deje ascender el frente de disolvente unos 8 a 9 cm, luego de este tiempo saque la placa y con un alfiler marque la altura máxima alcanzada. Una vez seca la placa observe las manchas coloridas, marque su posición y mida las distancias recorridas por las manchas y divida entre las distancias recorridas por el frente de disolvente y determine el Rf.

5.   INVESTIGACIÓN 

·         ¿Qué fases comprende la cromatografía? Explique.

·         ¿A qué se le llama eluyente?

·         ¿Qué características debe tener el eluyente?

·         ¿Qué mezcla de solventes se utilizaron y cómo lo prepararon?

·         ¿Aparte de la cromatografía de capa delgada defina otros tipos?

6.   BIBLIOGRAFÍA

DOMÍNGUEZ, X.1980. Experimentos de Química Orgánica. Limusa. México. 203p.

Manual de pruebas. Área de Bioactividad. Universidad Particular de Loja.  Ecuador.